组织糖胺多糖（GAG）总含量二甲基亚甲基蓝（DMMB）比色法定量检测

试剂盒产品说明书

主要用途

组织糖胺多糖（GAG）总含量二甲基亚甲基蓝（DMMB）比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取可溶性糖胺多糖，与二甲基亚甲基蓝染料结合，在丙醇解离溶液中，释放紫红色染料，由分光光度仪比色分析，定量检测组织样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种人体或动物组织（皮肤、肌肉等）、软骨、结缔组织、肿瘤组织等糖胺多糖水平检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。

技术背景

糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又称为粘多糖（mucopolysaccharide），是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖，由重复的二糖单位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），链接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖与核心蛋白（core protein）共价相联，构成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成为细胞膜和细胞外基质（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于发挥各种不同的作用，包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化，以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点，使用异染性（metachromatic）阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性条件下，特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物（Dye-GAG complex），在丙醇解离溶液中，释放出染料，通过分光光度仪（656nm波长）测定，来定量分析糖胺多糖的总含量。 

产品内容

清理液（Reagent A）                            60毫升

萃取液（Reagent B）                            20毫升

染色液（Reagent C）                        25毫升

解离液（Reagent D）                        25毫升

标准液（Reagent E）                       100微升

产品说明书               1份

保存方式

保存萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent C）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

恒温水槽或干式恒温仪：用于样品反应

微型台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品预处理  

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定200毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入到一个液氮冻存管

5． 即刻放进液氮罐过夜

6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

7． 放进一个1.5毫升离心管

8． 加入500微升萃取液（Reagent B） 

9． 强力涡旋震荡1分钟，充分混匀

10． 放进56℃恒温水槽孵育16小时

11． 放进90℃恒温水槽孵育10分钟

12． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管

14． 置于冰槽里备用

二、标准样品配制

1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2． 分别加入50微升清理液（Reagent A）到1至5号管

3． 移取50微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀

4． 小心移取50微升1号管稀释的标准液（Reagent E）到2号管，混匀

5． 小心移取50微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀

6． 小心移取50微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀

7． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

三、 标准曲线测定

1． 移取50微升上述配制的标准液（Reagent E）到1.5毫升离心管

2． 加入1毫升染色液（Reagent C）

3． 涡旋震荡15秒

4． 室温下孵育30分钟，避免光照，期间每隔5分钟涡旋震荡15秒（注意：可见紫色或粉红色沉淀）

5． 即刻放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g

6． 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）

7． 加入1毫升解离液（Reagent D）

8． 涡旋震荡15秒

9． 室温下孵育5分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）

10． 转移到新的比色皿

11． 即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得标准样品吸光读数

12． 重复实验步骤1至11四次

13． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准糖胺多糖含量（微克）

四、 样品测定

1． 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管

2． 加入1毫升染色液（Reagent C）

3． 涡旋震荡15秒

4． 室温下孵育30分钟，避免光照，期间每隔5分钟涡旋震荡15秒（注意：可见紫色或粉红色沉淀）

5． 即刻放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g

6． 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）

7． 加入1毫升解离液（Reagent D）

8． 涡旋震荡15秒

9． 室温下孵育5分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）

10． 转移到新的比色皿

11． 即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得样品吸光读数

12． 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量（微克）

五、 浓度计算

根据上述标准曲线样品对应糖胺多糖含量（微克）÷0.050（样品容量；毫升）＝微克糖胺多糖/毫升 

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括标准样品

2． 本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸（hyaluronate）的检测

3． 本产品可以检测硫酸软骨素（chondroitin sulfate）、硫酸角质素（keratan sulfate）、硫酸皮肤素（dermatan sulfate）、硫酸类肝素（heparan sulfate）等主要糖胺多糖

4． 本产品检测范围为0.2至5微克糖胺多糖

5． 操作时，须戴手套

6． 系统操作时，标准样品测定只需1次

7． 空白对照读数通常小于0.06，如果超过表明抽去上清操作不当

8． 孵育时，避免光照

9． 如果样品糖胺多糖含量过低，可以浓缩样品或增加样品量至100微升

10． 样品浓度可以表述为：微克糖胺多糖/组织重量；微克糖胺多糖/组织总蛋白等

11． 本公司提供系列糖类代谢检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感