产品用途定量检测细胞裂解样品中溶酶体酸性脂酶(LAL)活性。原理:底物胆固醇油酸酯经LAL水解产生游离脂肪酸,与醋酸铜反应生成蓝绿色产物,715nm处测定吸光度变化。
试剂组成清理液(A)120mL、裂解液(B)20mL、缓冲液(C)50mL、底物液(D)5mL、稀释液(E)50mL、显色液(F)10mL、专性液(G)1mL、标准液(H)1mL。
保存:4℃,有效期3个月。稀释液和标准液有毒性挥发性,注意密闭。
样品制备收集1-5×10⁷个细胞,清理液洗涤后加入裂解液1mL,冰浴DOUNCE匀浆20-40下。4℃先800g离心10分钟,取上清再10000g离心15分钟,弃上清。沉淀用缓冲液500μL重悬,蛋白定量后-70℃保存或冰浴待测。
标准曲线配制1号管:标准液400μL(2mmol/L)
2号管:稀释液200μL+1号管200μL(1mmol/L)
3号管:稀释液200μL+2号管200μL(0.5mmol/L)
4号管:稀释液200μL(0)
测定:900μL稀释液+100μL标准液+200μL显色液,涡旋60秒,1000g离心3分钟,取上层1mL于715nm读数。
样品测定
背景对照:缓冲液800μL+底物液100μL+稀释液100μL,37℃孵育30分钟。取100μL加稀释液1mL、显色液200μL,涡旋离心后测吸光度。
总活性:将背景对照中的稀释液换成待测样品(50μg蛋白),其余相同。
非特异活性:缓冲液750μL+底物液100μL+专性液50μL+样品100μL,其余相同。
计算
活性 =(油酸浓度×10×1)÷(0.1×30)÷蛋白浓度 = μmol/mg/min
特异活性 = 总活性 - 非特异活性
单位定义:37℃、pH5.0条件下,每分钟释放1μmol游离脂肪酸所需酶量。
注意事项操作时戴手套;样品须澄清;底物液粘稠可80℃加热;背景测定只需一次;样品读数需高于背景才有效。
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