主要用途

体液基质金属蛋白酶1（MMP2）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PLGLAR，在特定抑制剂存在与否的情况下，受到MMP1蛋白酶的水解，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体体液包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液等样品中基质金属蛋白酶1的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

技术背景

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-2，又称明胶酶A （gelatinase-A）或IV型胶原酶（type IV collagenase），其前体分子量为72kDa，激活后分子量为62和56 kDa。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白-5 （laminin-5）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-TNF-α）和神经（蛋白）聚糖（neurocan）。基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉粥样硬化等疾病有关。基质金属蛋白酶-1，又称间隙性胶原酶 （interstitial collagenase）或成纤维细胞胶原酶（fibroblast collagenase），其前体分子量为52（未糖基化）和57（糖基化）kDa，激活后分子量为42和47 kDa。它的作用目标是纤维胶原蛋白（fibrillar collagens）。基质金属蛋白酶-1与风湿性关节炎（结缔组织降解）、牙周病（periodontal diseases）和肿瘤发展转移有关；基质金属蛋白酶-1缺失将导致肌肉骨骼综合种（musculoskeletal syndrome）。基质金属蛋白酶1的活性检测通过荧光共振能量转移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体（donor）到覆盖供体波长的受体（acceptor），使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭（quench）。基于多肽底物PLGLAR两端标记的供体荧光探针7-甲氧基香豆素（7-methoxy courmarin）受到另一个受体基团二硝基苯二氨基异丁酰[N-3-（2,4-dinitrophenyl）-L-α-β-diaminopropionyl；Dap]的抑制而荧光淬灭（quench）。在特异性抑制剂GM1489（N-[(2R)-2-(Carboxymethyl)- 4-methylpentanoyl]- L-tryptophan-(S)-methylbenzylamide）存在与否的条件下，一旦多肽的Gly-Leu键受到MMP1水解，释放出具有强烈荧光的7-甲氧基香豆素多肽片段，据此根据其荧光强度（激发波长330nm，散发波长400nm）的变化，来定量测定基质金属蛋白酶1的特异活性。其反应系统为：

产品内容

缓冲液（Reagent A）        毫升

底物液（Reagent B）        微升

标准液（Reagent C）             微升

专性液（Reagent D）          微升

产品说明书            1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent B）和标准液（Reagent C）避免光照，有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

选择一：血浆样品

1． 准备好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）

2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里

3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）

5． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

选择二：血清样品

1． 准备好不含抗凝剂的储存管 

2． 抽取1毫升血液，置于储存管里

3． 室温下，静置30分钟，直至血液凝结

4． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）

5． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）

6． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

7． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

选择三：尿液/脑脊液/唾液/精液样品 

1． 准备好1.5毫升离心管

2． 移取1毫升液体到离心管 

3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管 

5． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如血清或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长330nm，散发波长400nm，间隔5分钟，读数6次（共30分钟）

3． 缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

三、 标准样品配制

1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2． 分别加入xx微升缓冲液（Reagent A）到1至5号管

3． 移取xx微升标准液（Reagent C）到1号管，混匀

4． 小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent C）到2号管，混匀

5． 小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent C）到3号管，混匀

6． 小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent C）到4号管，混匀

7． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

四、荧光测定

（一）样品总活性测定

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品、样品总活性

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到相应孔里

3． 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品（20微克纯化酶或100微克体液蛋白）（注意：样品须清澈）

4． 放进37℃培养箱里孵育10分钟

5． 分别加入xx微升底物液（Reagent B）

6． 轻轻摇动96孔板

7． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）

9． 根据标准曲线获得样品总活性对应甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）

（二）样品非特异活性测定

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：样品非特异活性

2． 移取xx微升缓冲液（Reagent A）到相应孔里

3． 加入xx微升专性液（Reagent D）到相应孔里

4． 加入20微升待测样品（20微克纯化酶或100微克体液蛋白）（注意：样品须清澈）

5． 放进37℃培养箱里孵育10分钟

6． 分别加入xx微升底物液（Reagent B）

7． 轻轻摇动96孔板

8． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）

9． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）

10． 根据标准曲线获得样品非特异活性对应甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）

五、计算样品活性

（一） 样品活性（总活性或非特异活性）

（二） 样品特异活性

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括标准液

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准液测定只需1次

4． 体液制备的所有操作均须在4℃状态下进行

5． 测试前，样品须处于新鲜收集

6． 样品须澄清，至关重要

7． 样品准备要点如下：

a) 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂

b) 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）

c) 由于TIMP等天然抑制剂的存在，血清样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用胶原酶潜酶活化剂（APMA）－12197）

8． 如果用户没有特定的滤波器，可以使用激发波长320至340nm之间的任一波长，散发波长390至420nm之间的任一波长

9． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 基质金属蛋白酶1活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5的情况下，每单位GM1489敏感性酶在单位时间内（每分钟）水解1纳摩尔的多肽底物PLGLAR

12． 本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感